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Western Blotting 检测试剂盒使用说明书  

2008-03-10 21:41:22|  分类: 论文写作、投稿、 |  标签: |举报 |字号 订阅

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Western Blotting 检测试剂盒使用说明书

产品编号: EK1001 ECM kit (小鼠IgG)

EK1002 ECM kit (兔IgG)

EK1003 ECM kit (羊IgG)

EK1004 ECM kit (大鼠IgG)

EK1005 ECM kit (小鼠IgM)

括号中指的是一抗种属来源,非指标本来源。所用试剂均可用中性TBS,PBS稀释。

试剂的保存: 40C可保存一年,避免反复冻融。

Western Blotting检测试剂盒内容

封闭试剂:10g蛋白干粉1包。

HRP标记各种与试剂名称相应的二抗。效价1:2000-10000。

ECM显色试剂:总量为100ml。含A液5ml (x20); B液5ml (x20);每个试剂盒足够10张膜或800cm2面积的膜显色。

工作原理

蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一, 电泳是指带电粒子在电场作用下 , 向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同,可分为:琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)最广泛。它的优点为:无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶。SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,它根据蛋白分子大小不同,迁移速率的不同而达到分离目的,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

免疫印记是将凝胶电泳的高分辨力和免疫化学检测的特异性融为一体。免疫印记技术首先借助凝胶电泳将蛋白质抗原分离,然后将凝胶中的蛋白质转印到膜上使之成为被分离的一个拷贝。免疫印记为检测样品中是否存在蛋白的抗原提供一种可靠的方法,该法鉴定蛋白质的原理是根据被测蛋白能于特异性抗体结合的特性并通过相对迁移率来体现该蛋白的分子量。如果想要了解样品中是否存在某一抗原,以及该抗原的含量或该抗原多肽链的相对分子质量以及亚型,是否与其他蛋白结合,蛋白质的酪氨酸残基是否发生磷酸化等有关问题均可采用免疫印记。

免疫印记包括多个简单步骤,可在一到两天完成,该方法具有高效,简便,灵敏等特点。

实验操作步骤:

1.蛋白质的样品制备:

1) 细胞培养蛋白质样品的制备:

1:胰酶分解后裂解:细胞培养至80%左右密度时,以含0.25%胰蛋白酶消化,室温,低速离心,弃上清。细胞经预冷的PBS漂洗3次,加入450μl裂解液反复吹打。

2:皿上直接裂解: 细胞培养至80%左右密度时,细胞经预冷的PBS漂洗3次,加入450μl裂解液,用细胞刮刀收集,转移至离心管中,反复吹打。

2)组织样品的制备: 新鲜组织块迅速置于预冷的生理盐水中,漂洗数次,按组织净重:裂解液=1:10的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆,离心收集上清(如有粘稠物可超声处理)

3)蛋白变性:处理后的样品加入样品缓冲液(按样品浓度1:1或1:2的比例)混匀,样品置1000C的水浴箱加热3-5分钟,10000g离心10分钟,取上清液。(样品可立即使用也可以分装冻存,-20℃可稳定保持数月。)

2.SDS-PAGE电泳:

1).制 胶: ①按比例配制分离胶(单体:双体=29:1),缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀,将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中,再在液面上小心注入一层水或正丁醇,以阻止氧气进入凝胶溶液中,静置90min。

②同前按比例配制浓缩胶,但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分,以连续平稳的液流注入凝胶溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡,静制90min以上以保证完全聚合。

2)预电泳: 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中,小心拔去梳子,加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。(目的是清除凝胶内的杂质, 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。

3)加 样: 预电泳后依次加入标准品和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。样品一般在1.0mm厚的胶 加样50-100ug/lane)。

4)电 泳: 加样完毕,选择适当的电压进行电泳可。一般采用恒压浓缩胶50V,分离胶60V,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳

3.转 膜:蛋白质经SDS-PAGE分离后,从凝胶中转移到固相支持物上,常用的支持物有:硝酸纤维膜即NC膜(AR0135)或PVDF膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后,取出凝胶,在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法,包括湿式电转印和干式电转印。

1)干式电转印: 将转印槽阴极平放工作台上,并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸,将电转印液浸透0.45um的N.C膜放在滤纸上,再将凝胶平放在N.C膜上,最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm厚的滤纸,根据凝胶面积按1-2 mA/cm2, 接通电源,经1-1.5小时电转印。

2)湿式电转印: 打开电转印夹,每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫,再各放三块转印液浸透的滤纸,滤纸与海面垫大小相同或与NC膜、凝胶大小相同均可,将凝胶平放在阴极侧滤纸上,最后将NC膜平放在凝胶上,按照 (-) 夹板-海棉-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-夹板 (+)装好,除尽气泡,夹好电转印夹。 电泳槽加满预冷电转印液,插入电转印夹,将电泳槽放入冰箱内,连接好电极,接通电流,转印夹的NC膜应对电泳槽的正极, 4℃ 250-300mA, 转印80min。

4、膜的封闭: 漂洗转印膜,室温,3次x10min, 以尽量洗去转印膜上的SDS (以免影响

抗体的结合),放入5%脱脂奶封闭液内,摇床震动,室温封闭2h或4℃过夜。1xTBS-T ,PH7.6洗液,室温漂洗10min。

5、抗体杂交:1) 封闭后的杂交膜放入杂交袋中,加入适当稀释的一抗(兔,小鼠或人),4℃孵育过夜或37℃孵育2h,1xTBS-T ,PH7.6洗液洗膜3次x10min。(一抗的稀释度,孵育时间,温度与显色强度,背景有直接关系。一般来说,阳性不强时可提高一抗浓度和延长孵育时间,而背景高,非特异性条带多,则降低抗体浓度和孵育时间)。

2)滴加过氧化物酶标记山羊抗兔(小鼠、人IgG)20℃-37℃,1.5小时或40C过夜 1xTBS-T洗膜 3 X 10min。

6、显色(ECM)

ECM显色剂配制:按1ml蒸馏水,加显色剂A、B各1滴混匀。将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液反应约1-5分钟。吸去印迹膜边缘显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,以确保X感光胶片的干燥。印迹膜转入暗室中使胶片曝光30'-5分钟。

11、显影,定影。 将曝光后的X感光胶片 (博士德有售,货号AR0134)放入显影液(博士德有售,货号AR0132)中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止,再放入定影液(博士德有售,货号AR0133)中定影,胶片可长期保存。

附录:

1:蛋白标准品的选择:Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix (博士德有售,货号: AR0130) 该标准蛋白包含有九种蛋白分子:180KD,116KD,97KD,58.1KD,39.8KD,29KD,20.1KD,14.3KD, 6.5KD 蛋白以经过生物素标记, 和待测样品一起电泳,转膜后,用过氧化物酶标记的Streptavidin Avidin (博士德有售,货号BA1088),进行检测,ECM显示.

2:对照的设置 内参照: 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白; 阳性对照: 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量; 阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞。

3:裂解液的制备:

组织裂解液(全细胞蛋白提取):1:Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4:NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6:PMSF 1 mmoL/L 7:Aprotinin1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml 其中:7,8,9作用不持久,要使用前加入。

以上博士德有售, 货号: 100ml/ AR0101; 500ml/AR0102 来自PIERCE

细胞裂解液:1:NP-40裂解体系: 150 mmoL/L Nacl ,1.0%NP-40或Triton-x-100,

50 mmoL/L Tris (PH8.0) 。

2:RIPA裂解体系: 150 mmoL/L Nacl, 1.0% NP-40或Triton-x-100 ,0.5%脱氧胆酸钠, 0.1% SDS, 50 mmoL/L Tris( ph8.0)。

4:样品缓冲液 : (1*SDS样品缓冲液)(博士德有售,货号AR0131)

50 mmoL/L Tris-HCL (PH8.0),100 mmoL/L DTT ,2 % SDS, 0.1% 溴酚蓝 , 10% 甘油。此液可以配置成不同的储存液,根据蛋白浓度而定,40C长期保存,用时与蛋白液按比例混合,其中DTT应临时加入,以防降解。

5:漂洗液 (TBS-T): 0.01M TBS-T: Tris 1.21g; NaCl 5.84g;800ml H2O用HCl调节PH到7.5,加H2O定容 至1000ml (加入0.05%或0.1%Tween-20)。

6:配制 凝 胶 储 液: T%=30% C%=1% arc:bis=29:1 过滤后4℃避光保存。

7:配制浓缩胶缓冲液: 1.0mol/L Tris-HCL P H6.8 过滤后4℃避光保存。

8:配制分离胶缓冲液: 1.5mol/L Tris-HCL PH8.8  过滤后4℃避光保存。

9:电泳缓冲液(5×): Tris 15g 甘氨酸72g SDS 5g 加H2O至1L, 临用时稀释5倍至1×SDS电泳缓冲液加入电泳槽中。

10:转印缓冲液(5×): Tris 15 g, 甘氨酸 72 g , 加水定容到1L, 一般不需调PH值 ,用时稀释5倍到1×转印缓冲液。如果采用PVDF膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以。

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