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日志

 
 

Western Blot常见问题及处理  

2008-03-10 21:44:53|  分类: 论文写作、投稿、 |  标签: |举报 |字号 订阅

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Western Blot常见问题及处理(一)

1、western blot 的优点

答: 灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便,特异性高。

2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白?

答: 原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了,你必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c) 你的抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,看是否有问题。

3、我的细胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢?

答: a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长, b) 也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。

4、我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB?

答:可以选择0.2μml的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。

5、我的目的带很弱,怎么加强?

答:可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏,有什么解决方法?

答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高牛奶浓度。

7、目标带是空白,周围有背景,是为什么?

答:你的一抗浓度较高,二抗上HRP 催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物。

8、我的胶片是一片空白,是怎么回事?

答:如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a) 二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光;b) ECM底物中H2O2,不稳定,失活;c) ECL底物没覆盖到相应位置;d) 二抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答:a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.;b) 显影时间过长。

10、DAB好还是ECM好?

答:DAB 有毒,但是比较灵敏,是HRP 最敏感的底物;ECM结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。

11、抗原检测出的分子量比资料上的大,是怎么回事?

答:a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体。b)蛋白本身的修饰如:糖基化,磷酸化等

12、蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Marker 转上去了,为什么?

答:可能是:a)样品浓度过低;b)转移时间不够,。

13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等?

答:NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般最好加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。

14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和western blot试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?

答: ① 免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。

② 两种实验的一抗有时候不能通用,公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

15、做Western Blot时,提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?

答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

16、细胞水平要做western blot,多少细胞提的蛋白够做western blot?

答:一般5×10^6就足够了

17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么?这样对western blot有无影响?

答:能,没有问题。

18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?

答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。

19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?

答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

20、我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?

答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,加20%甲醇。

21、想分离的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗?

答:200kd的蛋白不好做, 分离胶用7%,积层胶 3.5%。

22、如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?

答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的。

23、蛋白变性后可以存放多久?

答:-80℃,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分离胶应当采用7.5%,但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?

答:上述提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置。

25、二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?

解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BSA代替应该好一点.

26、问一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?

答:Western Blot一般上样30-100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。

27、做组织样品的western的时候,怎样处理样品?

答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF)。

28、问大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?

答:做200kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择>7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。

29、有什么方法可以提高上样量?

答:a)可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量;b)用5倍的上样缓冲液来稀释变性

30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求?

答:上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等,如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了, 但是不要超载.

31、一抗,二抗的比例是否重要?

答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。

32、要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?

答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。

33、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?

答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。

34、Western Blot 中抗体的可以重复应用吗?

答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。

35、在做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗?

答:可以。

37、转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好,为什么?

答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢, 你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。

38、做Western Blot时,同样的抗体免疫组化能做出,而Western Blot却不能?

答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做Western Blot和免疫组化。

39、如果是6×8转印膜,要加多少一抗?

答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。

40、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果。

答:无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液

41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗?

答:没什么问题,就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了;也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题,你可以重新配制一份观察;能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂。

42、蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?

答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd和66kd可以一起转,12%SDS-PAGE, 湿转120mA, 45-60min就可以了, 可以根据你实验室的经验调节;170kd 用7%SDS-PAGE,200mA 90-120min。

43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?

答:可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米).

44、我用的是可视marker,但是电泳总跑不全8条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过8%,10%,12%,都是这样。marker是新买的。

答:一般来说,是小分子量Marker跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

45、是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参?

答:对于发表文章的实验最好加内参,实验严谨。

46、核内抗原Western Blot内参选择什么合适?

答:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,在网上查查就可以选出你要的内参。

47、做半定量Western Blot,内参β-actin,GAPDH哪个好?

答:选用beta-actin就可以。

48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?

答:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法,一般来说都没有区别。

49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”,其中TBST最后那个T是Tween吗,浓度多大?

答:是Tween,配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl:8g, Tris base:2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 调节pH 至 7.4, 加水定容至 1L.

50、封闭,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如在室温里做,或者要在4度下?

答:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后4度过夜。

51、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?

答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。

52、怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道都能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电压有什么要求?

答:影响跑胶跑的质量,有以下几个因素:1、电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55v,分离胶75v就能跑得很好。2、胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶.

53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

答:小分子的蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小分子的就透过去了。

Western Blot常见问题及处理(二)

1.电泳中常出现的一些现象:

  ●︶ 条带呈笑脸状

原因:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

  ●︵ 条带呈皱眉状

原因:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。

  ●拖尾

原因:样品溶解不好。

  ●纹理(纵向条纹)

原因:样品中含有不溶性颗粒。

  ●条带偏斜

原因:电极不平衡或者加样位置偏斜。

  ●条带两边扩散

原因:加样量过多。

2.Western blot结果中背景较高

可能的原因及建议:

  ●膜封闭不够

延长封闭的时间;选择更加适合的封闭液。

  ●一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度。

  ●一抗孵育的温度偏高

建议4℃结合过夜。

  ●选择的膜容易产生高背景

一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。

  ●膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润。

  ●检测时曝光时间过长

减少曝光时间。

3.Western blot结果中杂带较多

可能的原因及建议:

  ●目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等),本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。

  ●目的蛋白有其它剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性。

  ●样本处理过程中目的蛋白发生降解

加入蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作。

  ●上样量过高,太敏感

适当减少上样量。

  ●一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体。

  ●一抗不纯

纯化抗体

  ●一抗或者二抗浓度偏高

降低抗体浓度。

4 . Western blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议:

  ●检测样本不表达目的蛋白

选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性。

  ●检测样本低表达目的蛋白

提高上样量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

  ●转移不完全或过转移

可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。

  ●抗体不能识别测试种属的相关蛋白

购买抗体前应当认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

  ●一抗孵育时间不足

建议4℃结合过夜。

  ●二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源的种属的抗体。

  ●洗膜过度

洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

5. 其它现象:

  ●膜上多处出现黑点或黑斑

原因:抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

  ●反白(条带显白色)

原因:目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

  ●蛋白分子量偏低或偏高

原因:胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶;小分子蛋白要用高浓度胶。

6.安全问题:

操作有毒试剂时,带手套和口罩,且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。

 

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