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即用型SABC----免疫组化染色试剂盒使用说明书  

2008-03-10 21:49:00|  分类: 论文写作、投稿、 |  标签: |举报 |字号 订阅

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 即用型SABC----免疫组化染色试剂盒使用说明书

 

产品编号: SA1020—小鼠/兔IgG(适于一抗为小鼠单克隆和兔多克隆抗体)

SA1021—小鼠IgG(适于一抗为小鼠IgG类单克隆抗体)

SA1022—兔IgG(适于一抗为兔多克隆抗体)

SA1026—小鼠IgM(适于一抗为小鼠IgM类单克隆抗体)

试剂的保存:4℃可保存一年,应避免冷冻。

工作原理:

SABC是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的,用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质,分子量47000。同亲和素一样,对生物素分子有极高的亲和力,是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。亲和素是一个碱性蛋白质(IP=10),经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性,IP=6.0~6.5,对组织和细胞的非特异吸附很低,基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。SABC即 StreptAvidin—Biotin Complex,。根据研究,SABC大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。大量的酶将保证SABC具有很高的敏感性。SABC兼具高敏感性,低背景和操作简便的优点。

试剂盒中内容:

1. 5%BSA封闭液:12ml。用于组织切片的封闭。

2. 二抗:12ml。亲和纯化抗体,标记长臂生物素。山羊抗小鼠IgG(或IgM)或兔IgG。

3. SABC:12ml。链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物。

用户自备试剂:

1. 粘片剂APES或POLY-L-LYSINE(博士德公司有售)。

2. 0.02 M PBS(pH7.2-7.6)配法:1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g, Na2HPO4 2.8g, NaH2PO4 0.4g。如果用的是含水磷酸盐,应加上分子式中水的含量。

3. 0.01M 枸橼酸盐缓冲液:1000ml蒸馏水中加枸橼酸三钠(C6H5Na3O7?2H2O)3g, 枸橼酸(C6H8O7?H2O ) 0.4g。

4. DAB显色试剂盒(博士德公司有售)。

免疫组化染色程序的选择:用户需根据抗原/抗体的特点确定程序,多数情况下要先比较各程序染色结果。

A程序:石蜡切片热修复抗原程序。适于核抗原,易被固定破坏的抗原。

B程序:石蜡切片酶消化程序。适于被固定遮避的抗原。

C程序:石蜡切片酶不消化/修复程序。适于稳定的抗原。

D程序:细胞涂片,冰冻切片染色程序。

A.石蜡切片微波修复抗原染色程序:

1. 载玻片防脱片剂处理:可选择APES或Poly-Lysine。捞片后置烤箱58-60 ℃30-60分以使切片紧密粘附。

2. 切片常规脱蜡至水。

3. 30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

4. 热修复抗原:将切片浸入0.01M 枸橼酸盐缓冲液(PH6.0),电炉或微波炉加热至沸腾 后断电,间隔5-10分钟后,反复1-2次。冷却后PBS(pH7.2-7.6)洗涤1-2次。

5. 滴加5%BSA封闭液,室温20分钟。甩去多余液体, 不洗。

6. 滴加适当稀释的一抗(小鼠或兔IgG),37 ℃ 1小时左右或20℃时2小时左右。也可4℃过夜。PBS(pH7.2-7.6)洗2分钟×3次。(一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说,阳性染色强度不够时,可提高一抗浓度和延长孵育时间;背景过高时,可降低一抗浓度和缩短孵育时间。)

7. 滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔、人IgG),20-37℃ 20分钟。PBS(pH7.2-7.6)洗2分钟×3次。

8. 滴加试剂SABC,20-37℃ 20分钟。PBS(pH7.2-7.6)洗5分钟×4次。

9. DAB显色:使用DAB显色试剂盒(AR1022)。取1ml蒸馏水,加试剂盒中A,B,C试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间,一般在5-30分钟之间。也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。

10. 苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。

B. 石蜡切片酶消化程序:

以下面的步骤代替A程序中的第4步:滴加复合消化液(博士德有售)5-10分钟。蒸馏水洗3次。也可以使用0.1%的胰蛋白酶作消化液。

C. 石蜡切片酶不消化/修复程序:

对于不需要微波修复或消化的抗原,省略A程序中的第4步即可。

D.血涂片,细胞和 冰冻切片染色程序

1.载玻片经防脱片剂处理(Poly-L-Lysine)。

2.抗凝血经分层离心后涂片;培养细胞也可涂片或贴片生长;冰冻切片室温风扇吹干。

3.固定方案首选4%多聚甲醛或10%福尔马林固定30分钟;对不能耐受甲醛固定的抗原,纯丙酮室温固定30分钟。蒸馏水洗。(干燥后可冰冻保存)

4. 30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温浸泡30分钟,以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次。

其余步骤和石蜡切片5-10步相同。

注意事项:如果染色背景过高,在SABC反应之后,DAB显色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN20的PBS(pH7.2-7.6)洗涤切片4次,单纯PBS洗2次,然后DAB显色

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