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免疫组织化学技术常用试剂的配制  

2008-03-10 21:50:52|  分类: 论文写作、投稿、 |  标签: |举报 |字号 订阅

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免疫组织化学技术常用试剂的配制

一、缓冲液

1. 0.01MPBS(PH7.2)液

NaCl       8g

Na2HPO4     1.15g

KH2PO4     0.2g (NaH2PO4)

加双蒸水至   1000ml

2. 0.05MTBS(PH7.4)液

Tris(三羟甲基胺基甲烷)         12.1g

Nacl                     17.5g

加双蒸水至                 1500ml

在搅拌下加浓HCL至PH7.4,再加双蒸水至2000ml。

3. 0.02MTBS(PH8.2)液

Tris                     4.84g

Nacl                     17.5g

BSA                     2.0g

NaN3                     1.0g

加双蒸水至                 1500ml

在搅拌下加浓HCL至PH8.2,再加双蒸水至2000ml。

(BSA—牛血清白蛋白;NaN3—叠氮钠,为防腐剂)。

4. 0.05MTB液(PH7.6)

先配制0.05MTB液:

Tris                     60.75g

1N HCL                   约420ml

双蒸水                   至1000ml

配制方法:先以少量双蒸水(300ml)溶解Tris,加入HCL后,再用1N HCL或1N NaOH将PH值调至7.6,再加双蒸水至1000ml。

用时将0.5MTB稀释10倍,即为0.05MTB液(PH7.6)液。

5. 0.05M醋酸缓冲液(PH3.5)

先配制0.1M的醋酸和醋酸钠溶液

0.1M醋酸液:

冰醋酸   5.75ml

双蒸水   加至1000ml

0.1M醋酸钠液:

醋酸钠     13.61g

双蒸水     1000ml

再配制0.1M醋酸缓冲液:

混合即可

  0.1M醋酸       210ml

  0.1M醋酸钠     790ml

用时将0.1M的醋酸缓冲液稀释5倍,即为0.05M醋酸缓冲液(PH5.2)。

6. 枸橼酸缓冲液

(1)PH3.5

枸橼酸       2.55g

枸橼酸钠     2.35g

双蒸水       加至100ml

(2)PH6.0

21.01g枸橼酸加入蒸馏水1000ml 0.1M枸橼酸

29.41g枸橼酸钠加入蒸馏水1000ml 0.1M枸橼酸钠

使用时取0.1M枸橼酸9ml和0.1M枸橼酸钠41ml,再加入蒸馏水450ml,即配成0.01M的枸橼酸缓冲液(PH6.0±0.1)。用于微波修复抗原时。

二、显色液

1. DAB (Diaminobenzidine) 显色液

DAB(3.3—二氨基联苯胺四盐酸盐) 50mg

0.05MTB(或0.01MPBS)         100ml

30%H2O2                 30~40μl

  配制方法:先以少量0.05MTB(或0.01MPBS)溶解DAB,充分溶解后加入剩余的TB或PBS,摇匀后(避光)过滤,显色前加入30% H2O2,宁少勿多,便于掌握反应过程。阳性为棕黄色颗粒。

DAB有致癌作用,操作时应格外小心,避免直接与皮肤接触,用后的器皿应充分冲洗,用后的DAB液不应冲入下水道,应集中深埋或清洁液处理后弃之。

2. AEC(3-amino-9-ethylcarbozloe)显色液

AEC(3-氨基- 9-乙基卡巴唑)     20 mg

二甲酰胺(DMF)           2.5 ml

0.05M醋酸缓冲液(PH5.5)     50 ml

30% H2O2                 25μl

  配制方法:先将AEC溶于DMF中,再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前加入30% H2O2液。镜下控制显色时间。阳性为深红色颗粒。

3. 4-氯-1萘酚(4-CL-1-NapHthol)显色液

4-氯-1萘酚               100 mg

无水乙醇                 10 ml

0.05MTB(PH7.6)           190ml

30% H2O2                       10μl

  配制方法:先将4-氯-1萘酚溶于无水乙醇中,然后再加入TB190ml,用前加入30%H2O2,显色时间5~20分钟。阳性结果为蓝或深蓝色。

4. α-萘酚显色液(1)

α-萘酚AS-BI磷酸盐             1mg

坚固红TR盐                 2mg

底物缓冲液                   2ml

二甲基甲酰胺(DMF)           40μl

配制方法:先将α-萘酚AS-BI磷酸盐溶于40μl DMF中,再加入底物缓冲液2l,临用前10分钟加坚固红TR盐。

底物缓冲液(PH8.2~8.3)

0.2M Tris                   50ml

0.1M HCL                   40ml

Mg2CL·6 H2O                 20.3mg

左旋咪唑                   20.4mg

双蒸水 加至                 100ml

结果为玫瑰红色,若在底物显色液中用坚固兰BB盐代替坚固红TR盐,终产物为深蓝色。

5. α-萘酚显色液(2)

α-萘酚AS-BI磷酸盐             5mg

DMF                       0.05ml

丙二醇缓冲液(0.05M,PH9.8)       5ml

坚牢蓝 BB                     2mg

配制方法:先将α-萘酚溶于DMF中,然后加入丙二醇缓冲液,临用前加入坚牢蓝BB,溶解过滤后使用。

丙二醇缓冲液(储备液)

2mol/L:

2-氨基-2-甲基-1.3丙二醇             35.64g

6mol/L HCL                     32ml

0.005M MgCL2                   4ml

左旋咪唑                       480mg

双蒸水 加至                   200ml

用HCL或NaOH调PH至9.8。

取上述储备液1ml用双蒸水稀释至40ml备用。

阳性结果为蓝色颗粒。

6. α-萘酚显色液(3)

α-萘酚                       15mg

DMF                         0.5ml

坚固蓝BB盐                   30mg

0.05M Tris-HCL(PH9.1)             50ml

左旋咪唑                     12mg

  配制方法:先将α-萘酚溶于DMF中,加入坚固蓝,再加入Tris-HCL缓冲液,最后加入左旋咪唑,完全溶解过滤后立即使用。显色为37oC,15~30分钟,用0.1%中性红复染30秒~1分钟自来水冲洗,丙酮分化5秒钟,流水冲洗。

阳性结果为蓝色,细胞核为红色或紫色。

银显色液

⑴ 硝酸银显色液

①2%明胶(或25%阿拉伯胶水溶液)       60ml

②枸橼酸缓冲液(PH3.5)           10ml

③对苯二酚           1.7g加双蒸水至10ml

④硝酸银             50mg加双蒸水至2ml

①~③液用前依次混合,最后加入④液,注意避光。

⑵ 乳酸银显色液

①20%阿拉伯胶                   60ml

②枸橼酸缓冲液(PH3.5)           10ml

③对苯二酚                 0.85g/15ml

④乳酸银                 110mg/15ml

以上①~③液用前依次混合,最后加入④液,注意避光。

上述两种显色液的25%阿拉伯胶可用双蒸水代替,但此时反应明显加快,要在镜下密切观察。

⑶ 醋酸银显色液

①硝酸银                   100mg/50ml双蒸水

②10%明胶                     10ml

③枸橼酸缓冲液(PH3.5)   1.7g加双蒸水至10ml

④对苯二酚                     600mg

配制方法:将对苯二酚溶于③液,然后将②③液混合过滤,再加入①液。

三、酶消化液

1. 0.1%胰蛋白酶

胰蛋白酶                 100mg

0.1%氯化钙(PH7.8)         100ml

配制方法:先配制0.1%氯化钙,用0.1M的NaOH将其PH值调至7.8,然后加入胰蛋白酶充分溶解。用前将胰蛋白酶消化液在水溶中预热至37oC,消化时间10~30分钟。

2. 0.4%胃蛋白酶

胃蛋白酶                 400mg

0.1N HCL                 100ml

配制方法:先配制0.1N HCL,然后将胃蛋白酶充分溶解,预热至37oC后使用,消化时间30分钟左右。

四、粘合剂

1. 铬矾明胶液

铬矾(或甲铬矾)           0.5g

明矾(Gelatine)           5g

蒸馏水                   1000ml

配制方法:先将少许蒸馏水溶解铬矾(硫酸铬钾)后,再加入明胶及蒸馏水,于70oC水溶液中胶溶化后置电动磁力搅拌器上,持续搅拌均匀,如有沉渣可过滤后使用。

将清洁的载玻片置上述液体中浸泡数分钟后,烤干备用,可防止脱片。

2.甲醛明胶液

  40%甲醛                 2.5ml

  明胶                   0.5g

  蒸馏水                   至100ml

配制方法:将少许蒸馏水(约80ml)将明胶加热溶解,待完全溶解后,加入甲醛,最后补充蒸馏水至100ml备用。用法同铬矾明胶液。

3. APES液

  APES                     1ml

  丙酮                     50ml

配制方法:取APES 1ml,加丙酮50ml,充分搅拌均匀备用。将清洁的载玻片放入APES液中20~30秒后,取出,用丙酮液洗去多余的APES液,注意不要留有气泡,晾干备用。经该方法处理的玻片具有良好的防脱片能力。

4.多聚赖氨酸液

多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)       1ml

蒸馏水                     10ml

配制方法:取市售Poly-L-Lysine 1ml,加入蒸馏水10ml,置塑料容器中,将清洁的玻片放入该液中5分钟,取出放置无尘干燥箱中晾干备用或60oC干燥箱烤干备用。所需容器不能用玻璃制品。经该方法处理的玻片具有很强的粘合能力。但价格较APES贵得多。

五、封固剂

1. 缓冲甘油

  纯甘油(分析纯)               20ml

  0.5M碳酸缓冲液(PH9.5)         20ml

配制方法:取纯甘油20ml,加入碳酸缓冲液20ml,充分混合,待气泡完全消失后,即可使用。

2. 甘油-TBS(PBS)

  纯甘油                 90ml

  0.01MTBS               10ml

  纯甘油                 75ml

  0.01MPBS               25ml

配制方法:按上述比例将甘油和TBS(PBS)充分混合后,置4oC静置,待气泡完全消失后,即可使用。

3. 甘油明胶

  明胶                 10g

  甘油                 10ml

  蒸馏水                 100ml

  麝香草酚               少许

配制方法:称取10g明胶于温热(40oC)的蒸馏水中,充分溶解后过滤,再加入12ml甘油混合均匀。少许麝香草酚是为了防腐。

4. 液体石蜡

液体石蜡因含杂质少,很少引起非特异性荧光,故常用于免疫荧光时标本的封固。

5.DPX

Distrene                 10g

酞酸二丁酯               5ml

二甲苯                 35ml

DPX为中性封固剂,用于多种染色方法均不易褪色,但使组织收缩较明显,故应尽量使其为均匀的一薄层。

六、 复染剂

1. Mayer氏苏木素

配制方法详见第一篇第四章第四节。

2. 甲基绿

  甲基绿                 2g

  蒸馏水                 100ml

复染后水洗数次,常规脱水封片。

3. 核固红

  核固红                 0.1g

  硫酸铝                 15g

  蒸馏水                 100ml

配制方法:将核固红溶入15%硫酸铝水溶液中,加热溶解,冷却过滤后备用。复染后用流水冲洗数分钟后,常规脱水封片。

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