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免疫和分子生物学实验常见问题及对策  

2008-03-11 16:48:19|  分类: 论文写作、投稿、 |  标签: |举报 |字号 订阅

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 一、免疫组化常见问题

    1.特异性染色弱或无

    特异性染色是指在有被检测目标抗原存在的部位出现明确高于背景的染色。实际工作中,在一抗及免疫组化检测系统无质量问题的情况下,仍有不能做出特异性染色的情况出现。其原因主要如下:

        (1)标本固定/包埋不当。固定剂不佳、固定时间过长、浸蜡包埋温度过高,会导致抗原完全破坏,这些都是常见原因。由于不同的抗原对环境耐受性不同,有些标本虽然能做出一些较好的指标,但不稳定和含量低的抗原可能已消失殆尽。

        (2)抗原修复问题。由于免疫组化技术的发展,现在能在石蜡切片中显示的指标很广。相应地,除了优质的抗体外,我们也越来越依靠各种暴露或称修复抗原的方法,包括酶消化、热修复、增强组织通透性。初次做一个指标时,最好能比较各种修复法的染色效果。

        (3)一抗、二抗强度不够。增加抗体浓度,延长反应时间可解决染色偏弱的情况。

    2. 背景染色过强;很多时候阳性染色也比较明显,但被过高的背景掩盖。只要一消除背景染色,阳性染色就呈现出来。其原因如下:

        (1)组织/细胞原因:有些组织特别容易引起背景染色,如皮肤、肝脏、肾脏等。

        (2)一抗、二抗作用强度过高。

        (3)洗涤不充分。

    对策包括:

        a. 延长封闭时间;

        b. 可调节一抗,二抗的稀释度,找到一个最佳浓度,使之能得到有效强度的信号,而非特异性的染色较低。

        c. 充分洗涤,将未结合上的非特异性的抗体洗掉,可在缓冲液中加0.02-0.2%Tween20。

    3. 假阳性 多数由抗体和有部分同源性的抗原间的交叉反应引起。主要解决办法是在保证阳性结果可见的前提下,尽可能高地提高抗体稀释度,使假阳性消失。

二、如何区分凋亡细胞和坏死细胞?

    凋亡细胞的结构光镜下一般是正常的。坏死的细胞形态结构都有变化,且周围有炎症细胞浸润。

三、原位杂交常见问题

    1.特异性染色弱或无

    原位杂交要显示的对象是mRNA,位于细胞浆中,其特点是容易讲解。细胞中的mRNA下降过多是原位杂交难以检测出来的首要原因。根据我们的经验,标本及时固定就能有效阻止mRNA的降解。所以标本的处理过程中,及时固定是最重要的。且固定液中要加入DEPC。所用的各种缓冲液最好新鲜配制。合适的消化,杂交温度的调节也能有效地增进特异性染色。

    2.背景染色高

    由于mRNA仅有四种核苷酸的排列组合,原位杂交中非特异性背景染色很容易出现。改变探针浓度和调整洗涤强度是解决非特异性背景染色最有效的办法。有时背景染色过高时,可以将原位杂交检测的第三步:加生物素化过氧化物酶-------省略掉

四、Western Blotting的常见问题及对策

问   题

出现的原因

解决方法

1. 胶片上存在反转印象 (如:亮的条带.黑的背景)

HRP的浓度过高

稀释HRP至少10倍

2. 膜上有黄色或棕色的沉积

HRP的浓度过高

稀释HRP至少10倍

3. 在暗室中条带过于明亮

HRP的浓度过高

稀释HRP至少10倍

4. 条带的发光时间持续了至 少8小时

HRP的浓度过高

稀释HRP至少10倍

5. 信号太弱或没有

1.太多的HRP积聚导致信号快速的消退

2.抗原或抗体的浓度不够

3.转印不成功

4.HRP或其他底物的效价降低

1.稀释HRP至少10倍

2.增加其浓度

3.寻找合适的转移方法和条件

4.选择其他的合适底物

6. 高背景

1.HRP浓度过高

2.封闭无效

3.不适合的封闭试剂

4.洗涤不充分和洗涤液的量

5.胶片曝光过度

6.抗原或抗体的浓度太高

1.稀释HRP至少10倍

2.寻找合适的封闭方法

3.选用其他的封闭试剂

4.增加洗涤的时间,次数

5.减少曝光时间

6.稀释抗原或抗体

7. 蛋白质条带上 有空泡影像

1.蛋白质没有被充分转印

2.膜没有预先浸湿

3.在胶片和膜之间有气泡

1.寻找合适的转移方法和条件

2.在转印前充分浸湿

3.在暴光之前赶走气泡

8. 胶片上背景弥散

HRP标记的抗体出现了积聚

用0.2μL的滤膜过滤HRP标记的抗体

9. 无特异性条带

1.HRP浓度过高

2.SDS促使非特异蛋白质条带黏附在目的蛋白质条带上

1.稀释HRP至少10倍

2.在操作过程中不要加SDS

 

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